Administration de streptomycine au côlon de rat à l'aide de nanofibres électrofilées
Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21503 (2022) Citer cet article
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Les nanofibres électrofilées chargées de médicaments sont des systèmes de transport de médicaments potentiels qui peuvent optimiser le traitement des maladies tout en réduisant l'impact sur les microbes commensaux. La faisabilité de nanofibres de pullulane chargées de streptomycine fabriquées à partir d'une procédure d'électrofilage vert utilisant de l'eau comme solvant a été évaluée. Nous avons mené une étude chez le rat comprenant un groupe traité avec des nanofibres chargées de streptomycine (STR-F, n = 5), un groupe traité avec des concentrations similaires de streptomycine dans l'eau potable (STR-W, n = 5) et un groupe témoin non traité (CTR, n = 5). La streptomycine a été chargée avec succès dans des nanofibres et délivrée par ce véhicule, ce qui a minimisé la quantité de médicament libérée dans le compartiment iléal de l'intestin. E. coli ingéré résistant à la streptomycine a colonisé jusqu'à 106 UFC/g de matières fécales, révélant un effet sélectif de la streptomycine même lorsqu'elle est administrée dans les faibles quantités autorisées par l'administration à base de nanofibres. Le séquençage des amplicons 16S du microbiote indigène a révélé des effets différentiels dans les trois groupes. Une augmentation des Peptostreptococcaceae dans le caecum des animaux STR-F peut indiquer que la fermentation des nanofibres a favorisé directement ou indirectement la croissance des bactéries au sein de cette famille. Nos résultats élucident les propriétés pertinentes des nanofibres électrofilées en tant que nouveau véhicule pour l'administration d'antimicrobiens au gros intestin.
Les antibiotiques sont essentiels pour contrôler et prévenir les infections, mais peuvent également perturber les bactéries non ciblées dans la lumière intestinale1,2,3. Les effets négatifs des traitements antimicrobiens comprennent la perturbation du microbiote intestinal commensal ainsi que le développement de bactéries résistantes aux médicaments3,4.
Les développements dans les technologies des biomatériaux ont fourni des supports de médicaments avancés, tels que les nanofibres, qui pourraient aider à surmonter les défis liés à l'efficacité thérapeutique des médicaments, réduire le risque de développer une résistance aux antimicrobiens5,6 et potentiellement minimiser l'impact sur le microbiote intestinal.
Fait intéressant, l'administration de médicaments par des supports nanostructurés a démontré des caractéristiques pertinentes telles qu'une inhibition efficace de la croissance bactérienne et une libération prolongée7. De plus, les systèmes d'administration de médicaments à base de polysaccharides, en particulier le pullulane, attirent davantage l'attention car ils sont non toxiques, stables, biocompatibles et biodégradables8,9,10,11. L'électrofilature, qui est un système de formation de nanofibres simple et rapide, progresse dans la création de nouveaux types de nanostructures, notamment des feuilles multicouches12,13, des nano-hybrides14,15 et des nanofibres noyau-coque14,16. Différentes stratégies potentielles d'électrospinning pour manipuler les comportements de libération de médicaments pour un effet thérapeutique amélioré ont récemment été examinées17,18. Contre l'utilisation généralisée des nanofibres électrofilées pour les applications d'administration de médicaments, plusieurs systèmes introduits à base de nanofibres électrofilées impliquent des solvants organiques dans la procédure de fabrication6. Ici, nous avons utilisé un procédé vert, incluant du pullulane comme biopolymère de qualité alimentaire et de l'eau comme solvant. Le pullulane est un polysaccharide linéaire produit à partir du champignon Aureobasidium pullulans et est constitué d'unités de type maltotriose, c'est-à-dire liées en α-(1 → 6) avec des (1 → 4)-α-d-triglucosides19. Ce modèle de liaison unique conduit à une adhérence et une résistance à la traction élevées du pullulan20. Contrairement à de nombreux autres polysaccharides, le pullulane se dissout facilement dans l'eau en raison du faible degré de liaison hydrogène. Il offre un bon potentiel de traitement pour former des films et des fibres et, en raison de sa nature non hygroscopique, présente une résistance mécanique intermoléculaire considérable8,19,21,22. De plus, ce biopolymère est un support approprié pour les applications d'administration de médicaments en raison de ses propriétés non mutagènes, non cancérigènes, biodégradables, mucoadhésives et cytoadhésives6,9,13.
Étant donné que la résistance aux antimicrobiens est l'une des plus grandes menaces mondiales pour la santé publique et que nous sommes actuellement à l'aube d'une ère post-antibiotique23, l'administration d'antimicrobiens spécifiques au site est préférée. Les approches qui augmentent la concentration locale d'antibiotiques uniquement dans les sites où ils sont censés avoir un effet, pourraient être un moyen de réduire le développement de la résistance aux médicaments. Par conséquent, cette étude visait à décrire l'impact de l'ingestion de nanofibres de pullulane chargées de streptomycine sur la communauté bactérienne intestinale chez le rat par rapport à l'administration de streptomycine dans l'eau potable. De plus, l'effet sélectif sur une souche bactérienne résistante ingérée a été évalué.
Des tests de diffusion sur disque, effectués par la méthode de Kirby-Bauer, ont confirmé que l'activité antimicrobienne de la streptomycine restait après le chargement dans des fibres électrofilées. Ainsi, les nanofibres chargées de streptomycine ont inhibé la croissance des souches sensibles d'E. coli et de S. aureus (Fig. 1). Dans l'ensemble, nous concluons que l'encapsulation du médicament n'a pas affecté les propriétés antimicrobiennes du médicament. Ainsi, les nanofibres électrofilées convenaient pour maintenir le niveau thérapeutique optimal du médicament antimicrobien in vitro. Une étude similaire réalisée avec l'amoxicilline a démontré que l'incorporation antimicrobienne de nanofibres ne compromet pas la libération et l'activité du médicament24. Par conséquent, les nanofibres électrofilées peuvent être pertinentes dans diverses applications dans le domaine de l'administration de médicaments.
Essai de diffusion sur disque. ( a ) Résultats de diffusion de disque S. aureus de pullulane chargé de streptomycine et ( b ) Résultats de diffusion de disque E. coli de pullulane chargé de streptomycine.
Une étude chez le rat a été réalisée pour étudier les effets des nanofibres porteuses de streptomycine sur le degré de colonisation d'E. coli MG1655-K12 résistant à la streptomycine. Avant l'inoculation, aucune résistance de fond à la streptomycine ou à la gentamycine n'a été détectée dans les échantillons fécaux de ces animaux (données non présentées). Les jours 1 et 2 après l'inoculation, beaucoup plus d'E. coli résistants à la streptomycine ont été trouvés dans les échantillons fécaux de rats ayant reçu de la streptomycine encapsulée dans les nanofibres (STR-F) ou dans l'eau potable (STR-W) que dans le groupe témoin (CTR) (Fig. 2a). Aucune différence n'a été observée entre STR-F et STR-W (Fig. 2a). Des nombres plus élevés d'E. coli résistants ont été trouvés dans les échantillons cæcaux des animaux STR-W, tandis que la différence entre le groupe STR-F et le CTR n'était pas significative (Fig. 2b, c). Aucune différence dans le nombre d'E. coli résistants entre les groupes n'a été observée dans les échantillons coliques et fécaux obtenus le jour 3, probablement parce que le traitement à la streptomycine a cessé le jour 2 dans les STR-W et STR-F.
L'UFC compte. (a) E. coli CFU compte par gramme de matières fécales au jour 1, au jour 2 et au jour 3 ; (b) E. coli CFU compte par gramme de contenu de caecum au jour 1, au jour 2 et au jour 3 ; ( c ) E. coli CFU compte par gramme de contenu du côlon au jour 1, au jour 2 et au jour 3. * (P <0,05); **(P < 0,01); *** (P < 0,001). Seuls quatre échantillons ont été obtenus du CTR le jour 1.
La streptomycine, administrée à raison de 5 g/L dans l'eau potable, est utilisée depuis des décennies dans des modèles animaux pour supprimer les bactéries anaérobies facultatives et permettre ainsi aux espèces de protéobactéries résistantes à la streptomycine ingérées de surmonter la barrière de colonisation25,26,27. Dans l'expérience actuelle, nous avons appliqué une concentration beaucoup plus faible (0,25 g/L) dans l'eau potable des rats STR-W pour tenter de faire correspondre la quantité absolue de 7 mg de streptomycine administrée sous forme de nanofibres aux rats STR-F. Néanmoins, nos résultats démontrent qu'il est possible d'obtenir une prolifération intestinale de bactéries résistantes à cette concentration 20 fois inférieure à la norme actuellement appliquée.
La mesure de la consommation d'eau réelle au cours de l'expérience a révélé que la streptomycine totale consommée par les rats STR-W était d'environ 12,5 mg, compte tenu d'un déversement estimé à 50 %. Comme mentionné ci-dessus, la streptomycine dosée par les nanofibres aux rats STR-F au cours de l'expérience était d'environ 7 mg.
La concentration de streptomycine libérée dans l'intestin à partir de nanofibres a été évaluée par ELISA du contenu intestinal de rat obtenu au jour 3. Fait intéressant, nous avons observé une concentration significativement (P <0, 005) inférieure de streptomycine dans les échantillons iléaux du groupe STR-F, par rapport au groupe STR-W (Fig. 3). Nous supposons que les capsules de gélatine enrobées commencent à se dissoudre dans l'intestin grêle et libèrent les fibres de pullulane électrofilées, qui ont des propriétés mucoadhésives9. Les nanofibres de pullulane se dissolvent ensuite et forment une construction mucoadhésive gélatineuse, retenant le médicament partiellement à travers l'iléon et se déplaçant dans le gros intestin, où davantage de médicament est progressivement libéré.
Concentrations de streptomycine. Carte thermique reflétant les niveaux approximatifs de streptomycine présents dans l'iléon, le caecum et le côlon Les niveaux de STR-W et de STR-F sont différents dans les échantillons iléaux (P < 0,005), tandis que les niveaux dans le caecum et le côlon ne diffèrent pas entre les deux groupes. Le test était saturé au-dessus de 50 ng/mL. La figure a été réalisée dans GraphPas Prism comme décrit dans la section méthodes.
Conformément à nos observations, les fibres noyau-enveloppe, qui sont produites par électrofilage coaxial, ont déjà montré une libération prolongée réussie de médicaments hydrophiles tels que la streptomycine28. En ce qui concerne les applications d'administration de médicaments utilisant des nanofibres de pullulane, plusieurs études se concentrent sur les propriétés de dissolution rapide du pullulane et le recommandent pour des approches d'administration rapide par voie buccale8,19,29,30 ou pour des applications de pansement6,31. Nos résultats suggèrent que les nanofibres de pullulane chargées d'antibiotiques conviennent également à la livraison dans le gros intestin, en raison des propriétés mucoadhésives du pullulane dissous.
Le séquençage des amplicons du gène ARNr 16S a été réalisé pour évaluer l'effet du traitement à la streptomycine sur le microbiote intestinal. La richesse microbienne était significativement réduite dans les échantillons fécaux des groupes STR-F (P = 0, 008) et STR-W (P = 0, 007), par rapport au groupe CTR (Fig. 4). Dans le caecum, une richesse légèrement plus élevée a été observée dans le groupe CTR que dans les échantillons STR-F.
Richesse microbienne dans le caecum, le côlon et les matières fécales. Les échantillons sont indiqués par des points, tandis que les barres horizontales marquent les moyennes. Les valeurs P provenaient du test de permutation de la moyenne et étaient représentées par : *(P < 0,05) ; **(P < 0,01); ***(P < 0,001).
La diversité bêta a été comparée entre les groupes sur la base de la dissimilarité Bray-Curtis et visualisée avec une mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS). Trois groupes distincts représentaient respectivement les échantillons STR-W, STR-F et CTR (Fig. 5a). Globalement, le traitement était plus influent que la localisation dans l'intestin, selon le modèle PERMANOVA (0,27 [R2 pour le groupe] vs 0,09 [R2 pour la localisation], P = 0, test de permutation avec 100 itérations). La comparaison par paires de tous les groupes à chaque emplacement était significative dans tous les cas, à l'exception des échantillons fécaux des deux groupes traités au STR (Fig. 5b).
Compositions microbiennes dans le caecum, le côlon et les matières fécales. ( a ) Les compositions microbiennes globales des échantillons au niveau ASV ont été évaluées avec une distance Bray-Curtis et visualisées avec une mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS). ( b ) Un tableau montrant la comparaison de la diversité bêta entre les groupes à un emplacement et les valeurs P sont dérivés des modèles PERMANOVA utilisant la distance Bray – Curtis. ( c ) Diagrammes à barres montrant la composition taxonomique des 10 phylums les plus abondants.
Ensemble, les Bacteroidetes et les Firmicutes constituaient plus de 99 % des ASV identifiés dans les échantillons de rats. Nous avons constaté une réduction significative de l'abondance relative des Firmicutes et une augmentation relative correspondante des Bacteroidetes dans les groupes STR-W et STR-F dans des échantillons de caecum, de côlon et de matières fécales (Fig. 5c).
Au niveau de la famille, des niveaux inférieurs de Lactobacillaceae ont été trouvés dans le caecum des animaux STR-F par rapport à la fois au STR-W et au CTR (Fig. 6), tandis qu'une abondance plus élevée de Peptostreptococcaceae, en particulier de Romboutsia, a été observée (Fig. 6). Les Peptostreptococcaceae sont des commensaux chez les rats sains32, et Romboutsia, qui appartient à la famille des Peptostreptococcaceae, se compose de micro-organismes anaérobies adaptés pour utiliser une large gamme de glucides et repose sur des acides aminés et des peptides exogènes pour la synthèse des protéines33. Nous supposons que les niveaux plus élevés observés de cette espèce dans le groupe STR-F que dans le groupe STR-W résultent de la fermentation des nanofibres dans le côlon, qui favorise directement ou indirectement la croissance des bactéries au sein de cette famille. Les parties non digestibles des nanofibres étaient composées d'unités maltotriose reliées par des liaisons α-1,6, résistantes aux enzymes intestinales des mammifères mais disponibles pour la fermentation bactérienne dans le gros intestin34.
Diagramme en arbre montrant la comparaison des abondances relatives des taxons entre les groupes. Le plus grand nœud au centre est le royaume des bactéries. Le long de la branche de l'arbre vers l'extérieur, le nœud suivant est le niveau du phylum, suivi ensuite de la classe, de l'ordre, de la famille et du genre. La taille du nœud est proportionnelle à l'abondance relative moyenne dans le niveau phylogénétique correspondant. Un nœud est étiqueté et coloré lorsqu'il a des abondances relatives significativement différentes (test de permutation) entre les groupes. La figure a été réalisée en R comme décrit dans la section "Méthodes".
La streptomycine peut être incorporée dans des nanofibres électrofilées sans perdre l'activité antibactérienne, et en outre, elle peut être retenue avec succès dans l'intestin grêle et délivrée au gros intestin de rats en dosant avec des nanofibres encapsulées. Nos résultats suggèrent que les nanofibres électrofilées représentent une alternative avancée pour la livraison d'antimicrobiens dans le gros intestin. Cette approche est susceptible de permettre de réduire la quantité d'antibiotiques nécessaires pour être efficace, et donc de réduire le risque de développement de résistances, et de moins perturber le microbiote indigène. En effet, l'apport par les nanofibres s'est avéré affecter le microbiote d'une manière différente de l'apport par l'eau potable.
Pullulan a été gracieusement fourni par HAYASHIBARA CO., LTD (Japon). L'eau a été purifiée à l'aide d'un système de purification d'eau Milli-QPlus 185 (Millipore, Bedford, MA) avec une résistivité supérieure à 18 MΩ·cm. Des disques standard de streptomycine (25 ug par disque) ont été achetés chez Oxoid, Danemark. L'hexaméthyldisilazane (HMDS) a été obtenu auprès de Merck (Allemagne). La streptomycine, la gentamycine, le tréhalose et le RSM (poudre de lait écrémé) ont été achetés chez Sigma-Aldrich, Danemark.
La streptomycine a été chargée dans des nanofibres électrofilées de pullulane avec des concentrations finales de 1 et 10 % respectivement (p/p ; poids de streptomycine par rapport au poids de polymère). Pour l'encapsulation de la streptomycine dans du pullulane, la poudre de streptomycine a d'abord été dissoute dans de l'eau, puis de la poudre de pullulane a été ajoutée à la solution pour obtenir la concentration souhaitée. Pour fabriquer 1 % ou 10 % de streptomycine sur des constructions Pullulan (p/p), une solution de streptomycine à 0,2 % ou 2 % (p/v) dans de l'eau a d'abord été préparée sous légère agitation à 25 ℃ pendant 4 h. Ensuite, de la poudre de pullulane a été ajoutée pour faire une solution à 20 % (p/v) de pullulane dans de l'eau et a été agitée pendant une nuit à température ambiante. Par exemple, pour la fabrication d'une feuille de streptomycine à 1 % (p/p) : nanofibres de pullulane, la streptomycine a été dissoute dans de l'eau (conc. 2 mg/mL) sous légère agitation à 25 ℃ pendant 4 h. Ensuite, de la poudre de pullulane (0,2 g) a été ajoutée à la solution de 1 ml pour obtenir la concentration finale souhaitée de 20 % de pullulane dans l'eau pour une électrofilature optimale. Enfin, la solution a été filtrée de manière stérile à travers un filtre de 25 mm (Sigma Aldrich) et utilisée pour l'électrofilage.
Pour l'électrofilage, un système d'électrofilage conventionnel personnalisé comprenant une source haute tension (Glassman, FJ50P2.4-F22), une pompe à seringue (Aladdin, AL-1000) connectée à une seringue avec une aiguille hypodermique de 21 G et un collecteur statique a été utilisé. Les paramètres de filature optimisés ont été réglés sur un débit d'alimentation de 1 ml/h, une tension de 14 à 16 kV, une distance entre la pointe de l'aiguille et le collecteur de 15 cm, une humidité de 35 % et une température de 25 °C. La chambre d'électrofilage comprenant la pompe et le collecteur a été désinfectée par EtOH 70% avant de commencer chaque procédure d'électrofilage.
Pour déterminer si l'efficacité de l'activité antimicrobienne de la streptomycine demeure après l'électrofilage, nous avons effectué un test de diffusion sur disque par la méthode Kirby – Bauer35. L'activité antibactérienne de la streptomycine chargée dans des feuilles de nanofibres a été analysée contre Gram-négatif (Escherichia coli (E. coli) MG1655 subst. K12 (ATCC 47076)) et Gram-positif (Staphylococcus aureus (S. aureus) (ATCC 2928)) bactéries sensibles à la streptomycine. Les souches E. coli et S. aureus ont été cultivées pendant une nuit dans des plaques Luria Bertani (LB) à 37 °C. Un inoculum pour chaque échantillon a été préparé et la turbidité de la suspension a été ajustée dans un densitomètre (Sensititre-Nephelometer, Thermo Fisher, Danemark) par rapport au standard 0,5 McFarland. Ensuite, une centaine de microlitres de l'inoculum ont été étalés sur des plaques de gélose Mueller-Hinton. Les feuilles électrofilées contenant 10 µg et 100 µg (de 1 et 10 % p/p de streptomycine : nanofibres de pullulane) ont été coupées avec un poinçon de biopsie de 6 mm, puis placées à côté des disques de streptomycine standard de même diamètre (25 µg) (Oxoid, Danemark) comme témoin. Des feuilles électrofilées non chargées de streptomycine (nanofibres de pullulane) ont été incluses comme témoins négatifs. Les échantillons ont été incubés à 35 °C pendant 16 à 18 h. Le diamètre de la zone d'inhibition a été mesuré et comparé aux valeurs du point de rupture fournies par les directives EUCAST (https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_11.0_Breakpoint_Tables.pdf).
Pour doser des rats avec des nanofibres chargées d'antibiotiques, les feuilles électrofilées de 10% de streptomycine:pullulan ont été coupées manuellement pour faire des particules carrées d'environ 1 mm de longueur. Ensuite, des capsules de gélatine à coque dure (Torpac taille 9) ont été enrobées dans une solution à 12 % (p/v) d'Eudragit L100 dans de l'IPA où du sébacate de dibutyle a été ajouté comme plastifiant dans un rapport de 5 % p/p par rapport à Eudragit. Enfin, les capsules ont été remplies de 12 mg de particules (équivalent à 1,2 mg de streptomycine par capsule) avant l'administration aux rats.
Pour savoir si la feuille électrofilée de nanofibres chargée de streptomycine affectait l'établissement de bactéries résistantes à la streptomycine dans l'intestin, nous avons réalisé une étude sur le rat impliquant l'inoculation orale des animaux avec la substance E. coli MG1655 résistante à la streptomycine marquée mCherry. K12, Taxon Identifier 511145 (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A4D6FVK6) en association avec de la streptomycine délivrée sous forme de nanofibres encapsulées, dans l'eau potable ou sans streptomycine comme contrôle (Fig. 7). La souche marquée par fluorescence a été choisie pour permettre une vérification facile par microscopie.
Plan d'étude. Représentation schématique de l'étude in vivo, représentant le CTR (témoin), qui a reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo, STR-F (nanofibres chargées de streptomycine), qui a reçu une capsule recouverte d'Eudragit 100S et chargée de particules de pullulane chargées d'antibiotiques deux fois par jour, et STR-W (streptomycine dans l'eau potable) a reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo et de la streptomycine dans l'eau potable (0,25 g/L). Tous les groupes ont reçu une dose unique de 108 UFC d'Escherichia coli résistant à la streptomycine. La figure a été créée dans BioRender par les auteurs.
Quinze rats mâles Sprague-Dawley âgés de 8 semaines (Charles River) ont été répartis en trois groupes de cinq et logés individuellement dans des scantainers (Scanbur). Après une période d'acclimatation de sept jours, les animaux ont été traités avec de la streptomycine soit dans de l'eau potable (STR-W), à l'intérieur de particules de nanofibres électrofilées (STR-F), soit n'ont reçu aucun médicament antimicrobien (CTR). Les rats CTR ont reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo, les rats STR-F ont reçu une capsule de gélatine à coque dure remplie de particules de pullulane chargées d'antibiotiques comme décrit ci-dessus deux fois par jour pendant 3 jours (jours 0, 1 et 2), tandis que les rats STR-W ont reçu une capsule de gélatine à coque dure placebo vide et de la streptomycine dans l'eau potable (0,25 g / L) pendant les trois mêmes jours (Fig. 7). Nous avons visé une concentration dans l'eau potable, qui ferait correspondre la consommation totale de streptomycine par les rats STR-W aux 7 mg environ administrés aux rats STR-F, considérant que la consommation moyenne d'eau se situait entre env. 30 à 50 mL d'eau/animal/jour. Pour cette étude, les E. coli résistants à la streptomycine et à la gentamycine ont été incubés sur de la gélose LB (SSI Diagnostica A/S) pendant 16 h, comme décrit précédemment. Une colonie a été transférée dans un bouillon LB additionné de 20 µg/mL de gentamycine et 100 µg/mL de streptomycine pendant une nuit/16 h à 37 °C sous agitation. La culture a été centrifugée à 5000 xg pendant 10 min, lavée et remise en suspension dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à une densité cellulaire de 109 UFC/mL. Vingt-quatre heures après le début du traitement à la streptomycine, tous les groupes ont reçu une dose unique d'environ 108 UFC de la souche. Les animaux ont été nourris et ont reçu de l'eau à volonté pendant toute la durée de l'expérience.
Des échantillons fécaux (environ 1 g) ont été prélevés avant l'inoculation et 24 h, 48 h et 72 h après l'inoculation. Après 72 h, les animaux ont été euthanasiés par asphyxie au CO2 suivie d'une décapitation. Les rats ont été disséqués et le contenu luminal a été recueilli de manière aseptique dans les régions distales de l'iléon, du cæcum et du côlon. Le contenu de ces coupes a été pesé et homogénéisé. Des dilutions au 1/10 ont été étalées sur des plaques de gélose LB additionnées de streptomycine (100 µg/mL) ou de gentamycine (25 µg/mL) (Sigma-Aldrich, Danemark), selon le cas. Le nombre d'UFC a été évalué après 24 à 72 h d'incubation à 37 ° C dans des conditions anaérobies. Des colonies aléatoires ont été analysées par spectrométrie de masse à l'aide de Bruker Reflex™ III MALDI-TOF (Bruker-Daltonik, Allemagne) pour s'assurer que les isolats correspondaient à E. coli K-12 MG1655.
Pour estimer la quantité de médicament libérée dans la lumière intestinale, un test ELISA a été effectué pour vérifier la concentration de streptomycine présente dans le contenu fécal. Les boulettes fécales de l'iléon, du caecum et du côlon ont été analysées. Les échantillons ont été homogénéisés et dilués, et la procédure a été effectuée conformément aux instructions du fabricant du kit SM Streptomycin ELISA (Elabscience, USA) (Catalogue # E-FS-E031). La densité optique (DO) a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques Biotek EL800 (Agilent, DK), réglé à 450 nm et 630 nm. Les données ont été traitées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8.1.1.
L'extraction d'ADN, la préparation de la bibliothèque et le séquençage ultérieur sur la plate-forme Ion Torrent ont été effectués comme décrit précédemment36. En bref, les échantillons consistaient en des échantillons fécaux à 72 h (n = 15), des échantillons de l'iléon (n = 15) et des échantillons du côlon (n = 15). L'ADN microbien a été extrait à l'aide d'environ 0,2 g de matériaux avec le kit d'isolement DNeasy® PowerLyzer® PowerSoil® de Qiagen. L'ADN extrait a été stocké à - 20 ° C avant utilisation.
L'amplification de la région V3 du gène de l'ARNr 16S a été réalisée comme suit : le mélange maître PCR consistait en 0,2 µL d'ADN polymérase haute fidélité Phusion (ThermoFisher Scientific F-553L), 4 µL de tampon HF, 0,4 µL de dNTP (10 mM de chaque base), 1 µM d'amorce directe (PBU ; 5ʹA-adapter-TCAG-barcode-CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ʹ) et amorce inverse 1 µM (PBR ; 5ʹ-trP1-adaptateur-ATTACCGCGGCTGCTGG-3ʹ) et 5 ng d'ADN fécal communautaire dans un volume de réaction total de 20 µL. Les deux amorces (TAG Copenhagen A/S) étaient liées à des adaptateurs de séquençage et l'amorce sens contenait en outre un code-barres unique de 10 pb (adaptateurs de code-barres Ion Xpress™) pour chaque échantillon. Le programme PCR consistait en une dénaturation initiale pendant 30 s à 98 °C, suivie de 24 cycles de 98 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 30 s, et enfin, 72 °C pendant 5 min pour permettre l'extension finale avant refroidissement à 4 °C. Des contrôles sans matrice ont été inclus pour chaque cycle de PCR, tous résultant en moins de 0,05 ng/µL. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide de billes magnétiques HighPrepTM PCR (MAGBIO®, AC-60005) avec un support magnétique à 96 puits (MAGBIO®, MyMag 96), conformément aux recommandations du fabricant. La quantité d'ADN a été mesurée à l'aide du test Qubit® dsDNA HS (InvitrogenTM, Q32851) et séquencée sur puce à l'aide des systèmes Ion OneTouchTM et Ion PGM avec un 318-Chip v2 incorporant la chimie Hi-Q dans des séries de 200 pb.
Les séquences brutes ont été démultiplexées avec les codes-barres et les amorces supprimées à l'aide de QIIME237. Les séquences obtenues ont ensuite été filtrées pour aller de 125 à 180 pb. Ces lectures prétraitées ont été analysées avec le pipeline DADA2 dans R38, en utilisant les paramètres recommandés pour Ion Torrent. Les variants de séquence d'amplicon obtenus (ASV) ont ensuite été annotés de manière taxonomique à l'aide de la base de données Ribosomal Database Project (RDP) (version 11.5).
L'analyse statistique a été réalisée avec QIIME2, R et GraphPad Prism Software 8.1.1. Les échantillons ont été raréfiés à une profondeur égale de lectures avant de calculer la richesse. Le nombre d'UFC, la concentration de streptomycine, la richesse microbienne et l'abondance des taxons ont été comparés avec un test de permutation bilatéral. Les ASV (variant de séquençage d'amplicon) avec moins de 0,01 % d'abondance relative ont été supprimés avant une analyse plus approfondie. La diversité bêta a été évaluée sur la base de la matrice de distance Bray-Curtis et comparée à l'analyse multivariée permutationnelle de la variance (PERMANOVA). La composition taxonomique montrée avec les arbres a été générée avec le package R "metacoder"39. Le seuil de signification a été fixé à 0,5. La comparaison des niveaux de streptomycine évalués par ELISA dans les caeca des animaux STR-F et STR-W a été effectuée par test t en supposant des variances égales.
L'Inspection danoise des expériences sur les animaux a approuvé l'essai sur les animaux sous le numéro de licence 2020-15-0201-00484. Le protocole d'expérience a été pré-enregistré par la BioFacility de DTU. Les animaux ont été surveillés quotidiennement pendant l'expérience, et l'expérience a été réalisée conformément aux directives nationales danoises et supervisée par le Comité du bien-être animal de l'Institut pour le soin et l'utilisation des animaux. Les méthodes sont rapportées conformément aux directives ARRIVE.
Les données de séquence ont été déposées au NCBI Sequence Read Archive sous le numéro PRJNA758361.
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Cette recherche a été financée par la Novo Nordisk Foundation (NNF17OC0026910), MIMIO–Microstructures, microbiota and oral delivery et par la Danish National Research Foundation (DNRF122) et la Villum Foundation (Grant No. 9301), Center for Intelligent Drug Delivery and Sensing Using Microcontainers and Nanomechanics (IDUN). Les auteurs remercient les gardiens d'animaux de DTU BioF pour la manipulation des animaux.
Ces auteurs ont contribué à parts égales : Priscila R. Guerra et Fatemeh Ajalloueian.
Institut national de l'alimentation, Université technique du Danemark, 2800, Kgs. Lyngby, Danemark
Priscila R. Guerra, Shaodong Wei, Katja Ann Kristensen, Martin Iain Bahl et Tine Rask Licht
Département de technologie de la santé, Université technique du Danemark, 2800, Kgs. Lyngby, Danemark
Fatemeh Ajalloueian & Anja Boisen
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PRG et FA ont contribué à la conception de l'étude, à la préparation des nanofibres, à l'étude in vivo, à l'analyse des données et à la préparation du manuscrit. KAK a contribué à l'étude in vivo, à l'ELISA et à la préparation du séquençage. SW a contribué à l'analyse des données et à la préparation du manuscrit. MIB, AB et TRL ont contribué à la conception de l'étude, à l'analyse des données et à la préparation du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit.
Correspondance à Tine Rask Licht.
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
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Réimpressions et autorisations
Guerra, PR, Ajalloueian, F., Wei, S. et al. Livraison de streptomycine au côlon de rat à l'aide de nanofibres électrofilées. Sci Rep 12, 21503 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z
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Reçu : 18 août 2022
Accepté : 05 décembre 2022
Publié: 13 décembre 2022
DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25769-z
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